Sensor Amperométrico Para Determinação Da Atividade Da Enzima Glutationa Redutase Em Hemolisado De Hemacias

Este processo descreve o desenvolvimento de um sistema amperométrico para dosagem da atividade da enzima glutationa redutase em hemolisado de hemácias. O substrato da enzima (GSSG), sua coenzima (NADPH) e um oxidante da glutationa reduzida (DTNB), diluídos em tampão fosfato/EDTA foram depositados em cima de uma membrana lipofílica disposta sobre 2 eletrodos de platina. A amperagem foi monitorada durante 3 minutos após a adição da amostra. A aplicabilidade deste sistema foi avaliada em amostras de hemolisado de hemácias e sua eficiência foi comparada com o método espectrofotométrico de dosagem da atividade da enzima. As vantagens deste novo método são a rapidez e confiabilidade do resultado e a facilidade de ser usado fora do laboratório, permitindo seu uso por profissionais do esporte e da medicina na avaliação de estresse oxidativo.BR0202893 (A)G01N33/573G01N33/573BR20020202893G01N33/573G01N33/57

Papel dos ions de ferro na iniciação do processo de peroxidação lipidica em mitocondrias isoladas de figado de rato

Orientador: Lucia Pereira da SilvaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Neste trabalho estudamos o papel dos íons de ferro na peroxidação lipídica induzida por FeSO4 em mitocôndrias isoladas de fígado de rato (MFR). Na literatura aparecem duas teorias distintas para explicar o papel dos íons de ferro na iniciação da peroxidação lipídica. A primeira propõe que o ferro é o catalisador das reações de Haber-Weiss e de Fenton que produzem o radical hidroxila (OR) que atacaria os ácidos graxos polinsaturados das membranas. Uma segunda hipótese contesta a primeira, por considerar que o 'OH é muito reativo para difundir-se dos sítios onde é formado até a parte hidrofóbica da membrana, onde estão os ácidos graxos passíveis de ataque. Neste caso, a proposta é que a peroxidação lipídica seria induzida por complexos radicalares fonnados por Fe2+, Fe3+ e O2. Estas espécies teriam reatividade suficiente para abstrair átomos de hidrogênio das pontes metilênicas entre as duplas ligações dos ácidos graxos polinsaturados. Nossos resultados. mostram que a peroxidação lipídica induzida por FeSO4 causa alterações na fluidez das membranas mitocôndriais e é dependente de uma relação Fe2+/Fe3+ equimolar para atingir seu efeito máximo. Fatores que levem a um aumento na velocidade de oxidação do Fe2+ a Fe3+ pelo O2 contribuem para um aumento significativo da lipoperoxidação. Entre esses estão a presença de H2O2, o vazamento de elétrons quando as mitocôndrias estão energizadas, e íons como Pi presentes no meio de reação. Os experimentos em que a peroxidação lipídica foi inibida pelo sequestrador de radicais butilhidroxitolueno (BHT) permitem afirmar que a iniciação do processo peroxidativo depende da geração de uma espécie radicalar além da presença de FeSO4. O fato do manitol, conhecido sequestrador do radical hidroxila, não ter apresentado efeito inibitório sobre essa peroxidação, somado à observação anterior, permite descartar a hipótese de ser o radical hidroxila o iniciador do processo. Os resultados aqui apresentados, corroboram a hipótese de que complexos radicalares de valências mistas de ferro e 02 seriam os iniciadores da peroxidação lipídica induzida por FeSO4 em mitocôndrias isoladas, nas condições por nós estudadasAbstract: Here we have studied the role of iron ions on the mitochondrial lipid peroxidation induced by FeSO4 in isolated rat liver mitochondria. There are two hypothesis to explain the role of iron ions on the initiation of this peroxidative process. The first one suggests that iron catalyses Haber Weiss and Fenton reactions generating the hydroxyl radical (OR). This later would attack the polly saturated fatty acids of the membrane phospholipids. The second explanation discards a direct participation of OIL as it is a very reactive species to difuse from its generating site to the hydrophobic part of the membrane, where are situated the fatty acids. In this case, the proposal is that the peroxidative process would be initiated by complexes of Fe2+ and Fe3+ and O2. These species would be reactive enough to react with the hydrogen from the methylenic bridges between the polly saturated fatty acid double bonds. Our results show that the FeS04-induced lipid peroxidation causes alterations on the mitochondrial membrane fluidity and the maximum effect is reached when an equimolar Fe2+/Fe3+ relation is achieved. Conditions favouring an increase on the Fe2+ to Fe3+ oxidation by O2 contribute to a significant increase on lipid peroxidation. Among these are the presence of H2O2, the electron leak occuring when energized mitochondria were used and phosphate ions in the reaction medium. The experiments showing that the peroxidation is inhibited by butylhydroxytoluene (BHT), a known radical scavenger, lead to the conclusion that to initiate the peroxidative process a radical should be generated besides the presence of FeSO4. As mannitol was found unable to inhibit this process and it is known that mannitol scavenges OH, the hypothesis that hydroxil is the radical species needed to initiate this process can be discarded by our results. Moreover, our data support the proposal that complexes of iron mixed valences and O2 would be the real initiators of the lipid peroxidation induced by FeSO4 in isolated mitochondriaMestradoBioquimicaMestre em Ciências Biológica

Marcadores de estresse oxidativo induzido pelo exercicio fisico e tecnologia para sua quantificação

Orientador: Denise Vaz de MacedoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O estresse oxidativo induzido pelo exercício físico, dependendo do nível atingido, é um fator importante tanto nos processos que levam à melhora da performance quanto nos que induzem fadiga ou lesão muscular. O nosso principal objetivo foi responder se as respostas induzidas por diferentes protocolos de treinamento podem ser quantificadas através de marcadores de estresse e desta forma serem aplicadas para o diagnóstico de "overreaching". Para isso, analisamos marcadores sanguíneos e musculares em diferentes situações de exercício físico. Primeiramente mostramos que a concentração de TBARS na urina e a concentração de proteínas carboniladas (PC) e grupamentos sulfidrila no plasma refletem as diferenças na adaptação induzida por dois tipos de treinamento distintos, contínuo e intermitente. Em seguida, mostramos que após um exercício exaustivo a cinética dos biomarcadores de ataque no músculo apresenta um aumento, com pico 3 horas após o exercício, e que se reflete no sangue 6 horas após o estímulo. Esse estresse é acompanhado pela queda na atividade do sistema antioxidante muscular. O pico de concentração de TBARS e PC no músculo coincide com o pico de atividade da creatina quinase no plasma. Mostramos ainda que há uma correlação positiva entre o pico de concentração de TBARS no músculo com o do sangue e de ambas com o pico da CK plasmática, não ocorrendo o mesmo com a de PC. Esses dados indicam que a coleta dos biomarcadores no tempo certo permitem a utilização de amostras de sangue para o acompanhamento do estresse oxidativo induzido pelos diferentes tipos de exercício, de forma que o treinamento induza o aumento desejado da performance, sem no entanto, provocar danos musculares. Outro ponto importante refere-se à metodologia adequada para determinação desses marcadores. Assim, desenvolvemos um sensor amperométrico para a análise da atividade da enzima glutationa redutase para ser utilizado em campo. Este apresentou uma boa linearidade da resposta em função da atividade entre 0-0,40 UI/mL, usando-se 3_L de hemolisado de hemácias, que pode ser obtido a partir de uma gota de sangueAbstract: Physical exerci se induced oxidative stress is widely documented in literature. However, training is essential to improve the performance leading to an adaptative response, although it can lead also to oxidative damage of cellular strutures and ultimately to tissue injury. This points the importance of choosing the best suitable training programo Our aim was to answer if the induced response obtained employing different training protocols could be quantified through the determination of oxidative stress biomarkers and used to overreaching diagnosis. Our approach was to analyse blood and muscle biomarkers in different exerci se situations. First we showed that the variation of TBAR5 concentration in urine and the concentration of plasma carbonyl proteins and sulfhydryl groups reflected the different adaptations induced by two types of training protocols: continuous and intermittent training. Than we showed that after an exhaustive exercise the biomarkers of oxidative attack reached maximum values at 3 hours after the exercise, resulting in the blood maximum values 6 hours after the stimulus. This stress was followed by the decrease of the muscular enzymatic antioxidant system. The muscle TBAR5 and carbonyl proteins peak coincided with the peak concentration of plasma activity of creatine kinase. There was a positive correlation when we compare the concentration of TBARS in both muscle and blood, and both with plasma creatine kinase activity. There was no such correlation with the carbonyl protein concentrations. Our data indicated that the correct time of sampling is an important factor to allow the use of blood samples to follow the different exercise-induced stress in order to prevent overreaching. Another important point is how to develop a suitable method for determination of these biomarkers. 50, we built an amperometric sensor for the glutathione reductase activity to be used in the ground. This sensor has the accuracy for 0-0.4 IUjmL using 3J.1L of erytrocyte haemolisate, obtained from a blood droDoutoradoBioquimicaDoutor em Biologia Funcional e Molecula

FONTES DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO NA MUSCULATURA ESQUELÉTICA DURANTE O EXERCÍCIO

O músculo esquelético gera constantemente espécies reativas de oxigênio, através da reduçãomonoeletrônica do oxigênio molecular. Durante o exercício físico o consumo de oxigênio pelamusculatura esquelética exercitada pode ser aumentado em aproximadamente 100 vezes.Acredita-se que a geração de espécies reativas de oxigênio deve ser proporcional a esteaumento. O objetivo deste trabalho é apresentar todos os possíveis locais e mecanismos deprodução de espécies reativas de oxigênio na musculatura esquelética durante o exercíciofísico. A tradicional visão de que o aumento do consumo de oxigênio e o aumento do fluxo deelétrons pela cadeia de transporte de elétrons mitocondrial regulam a produção de espéciesreativas de oxigênio durante e após o exercício pode não ser exclusiva, nem a mais importanteao considerarmos os vários tipos de exercício

DIGESTÃO PROTÉICA USANDO DIGESTIVOS ENZIMÁTICOS COMERCIAIS – UMA AULA PRÁTICA

Este trabalho propõe uma aula prática para estudar a digestão de proteínas porproteases presentes em fármacos com digestivos enzimáticos, com simulação dascondições de pH, temperatura e agitação do estômago e do intestino através do usodo dissolutor. Este experimento permite que os alunos dos primeiros semestres dagraduação aprendam a utilizar equipamentos simples e técnicas fundamentais para oestudo da digestão de proteínas. Este experimento permite ainda a discussão deconceitos sobre estrutura e função de proteínas, pH e temperatura adequados e aindaconceitos iniciais de enzimologia

DIGESTÃO DE CARBOIDRATOS USANDO DIGESTIVOS ENZIMÁTICOS COMERCIAIS – UMA AULA PRÁTICA.

Este trabalho mostra uma aula prática na qual se estuda a digestão decarboidratos “in vitro” utilizando amido gelatinizado como substrato e doismedicamentos comerciais indicados para problemas digestórios, como fonte deamilase. As reações enzimáticas foram feitas no equipamento dissolutor a 37º C, comagitação constante e usando meios que simulavam o pH do estômago e em seguida opH do intestino delgado. Para avaliar a eficácia das enzimas pancreáticas nosdigestivos, foi feita uma reação com amilase pancreática pura. Determinou-se aconcentração de glicose no meio de reação 0, 30, 60, 90 e 120 min após o inicio dareação. Nossos resultados mostram que há diferenças entre a atividade amilase dosdois fármacos

Biossensor Baseado Em Hrp Para Avaliação Rápida Da Capacidade Antioxidante De Extratos Vegetais

BIOSSENSOR BASEADO EM HRP PARA AVALIAÇÃO RÁPIDA DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS VEGETAIS. Utilizando a metodologia baseada no desenvolvimento e aplicação de dispositivos químicos, como os biossensores, procurou-se caracterizar uma importante aplicação do biossensor eletroquímico para detecção de compostos fenólicos. O biossensor amperométrico, foi aplicado para avaliação da capacidade antioxidante de extratos de chás cuja propriedade antiradical é amplamente conhecida. Esta avaliação foi feita através da correlação do teor de compostos fenólicos, em termos de fenóis totais, quantificados pelo biossensor e a atividade antioxidante total (AAT) pelo método do radical relativamente estável DPP° (1,1-difenil-2-picrilhidrazil). O efeito antioxidante foi avaliado baseado no cálculo de IC50. IC50 representa a concentração necessária de antioxidante para reduzir 50% da concentração inicial de DPPH°, cuja concentração remanescente do radical no meio reacional foi calculada por curva de calibração utilizando o Trolox como composto de referência. Amostras de chá preto mostrou melhores valores de IC50 (IC50 = 0,44µmo11 ± 0,091) em comparação ao chá mate (IC50 = 11,5 µmo11 ± 0,32). O coeficiente de correlação em ambas as amostras de chás permitiu obter a atividade antioxidante total através das seguintes relações: AAT (chá mate) = 0,84 (± 0,08) [fenóis totais] + 2,83, R = 0,986 e AAT (chá preto) = 39 (± 3) [fenóis totais] + 2,51, R = 0,989. Estes resultados permitem concluir que pela medida do biossensor é possível determinar de maneira rápida, fácil e seletiva a capacidade antioxidante de extratos vegetais.BR0303792 (A)C12Q1/28C12Q1/28BR20030303792C12Q1/28C12Q1/2

Adequacies Of Skin Puncture For Evaluating Biochemical And Hematological Blood Parameters In Athletes.

The authors tested the effect of blood sampling (skin versus venous puncture) on some biochemical and hematological blood parameters in athletes to answer whether skin puncture could be used as a substitute for venous puncture. Comparative study of 2 methods of blood samples collection. The blood was collected in the same athletes at 3 different moments of the preparatory training phase. Fourteen male indoor soccer players (22 +/- 1 years old) and 7 female handball players (18 +/- 1 years old) participated. Blood was collected in heparin and K3EDTA by Vacutainer BD or Microvette Sarstedt system for biochemical and hematological analyses, respectively. There were no significant statistical differences between the 2 methods for the values of creatine kinase, urea, creatinine, lymphocytes, and platelets. The other hematological analyzes and uric acid exhibited significant higher values in skin blood, although they were all within the normal expected range. A high degree of correlation was observed between the 2 techniques for all parameters. Skin puncture is a reliable, easy, accurate, and less invasive sampling method for assessing hematological and some biochemical parameters in athletes, respecting that blood samples should always be obtained from the same site, especially in follow-up studies.16418-2